使用mRNA脂质纳米粒子进行可转移血小板的基因工程细胞疗法

血小板输注对于控制出血和止血功能障碍至关重要，并且可以扩展到用于多种疾病的细胞疗法。创建此类细胞疗法的努力需要研究人员修改供体血小板以表达治疗性蛋白质。然而，目前，对从献血者收集的血小板进行基因改造的适当方法仍然难以捉摸。

在《科学进展》杂志上发表的一项新研究中，JerryLeung和来自加拿大不列颠哥伦比亚大学、日本北海道大学和美国多个机构的纳米医学、生物化学和分子生物学科学家团队描述了一种基于含有用于人和大鼠血小板中外源蛋白表达的mRNA的血小板优化脂质纳米颗粒。

当研究小组测试mRNA-脂质纳米颗粒文库时，所得的外源蛋白表达与血小板激活无关。转染的血小板保留了止血功能，并在输注给大鼠后在血管损伤区域积聚，具有扩大血小板治疗潜力的能力。

血小板与止血

血小板是止血不可或缺的一部分，通常会输注血小板以恢复患者的止血平衡。这些血小板可以扩展到其他适应症，例如治疗败血症、炎症和关节炎的细胞疗法。基因修饰的血小板可以创造表达治疗性蛋白质的新细胞疗法，可用于修饰供体血小板。现有的电穿孔、病毒载体和商业转染方法尚不能编辑供体血小板并表达外源蛋白。

间接方法可以通过慢病毒载体靶向血小板前体干细胞，在血小板或血小板样颗粒中表达外源蛋白。必须对供体来源的血小板进行功能修饰才能创造出真正的血小板细胞疗法。

先前用含有mRNA的脂质纳米颗粒转染血小板的尝试已显示出将mRNA递送到血小板中的可能性，而脂质纳米颗粒技术的进步提高了其接触更广泛人群的潜力。

在这项工作中，Leung及其同事报道了mRNA脂质纳米粒子直接转染供体血小板以表达外源蛋白的能力。这种血小板可以用mRNA脂质纳米颗粒进行修饰，以维持其功能并在伤口局部积聚，并在凝血障碍大鼠输血后调节体内平衡。

脂质纳米颗粒促进血小板中外源蛋白的表达

为了确定血小板的有效转染方法，研究小组使用几种转染剂传递编码NanoLuc荧光素酶(NanoLuc)的mRNA，并测量其表达。虽然在不使用转染剂的情况下使用游离mRNA或使用商业mRNA递送剂处理的血小板中未检测到NanoLuc，但该过程允许将大量mRNA摄取到血小板中。

Leung和团队通过使用mRNA-脂质纳米颗粒制剂检测NanoLuc表达，该制剂类似于临床证明可治疗遗传性淀粉样变性的小干扰RNA-脂质纳米颗粒。研究小组将mRNA脂质纳米粒子转染后的血小板活化量与未经处理的血小板进行了比较。

为了确定最适合运输血小板的mRNA-脂质纳米颗粒配方，他们优化了三个主要成分;可电离脂质、连接脂质和聚乙二醇脂质。他们筛选了10种可电离脂质和两种永久阳离子脂质，并测量了它们的蛋白质表达、mRNA摄取和激活以支持蛋白质合成。

经过LNP处理的血小板保持其激活能力并有助于血栓的生长和坚固。(A和B)在没有激动剂或ADP、CRP-XL或凝血酶刺激的情况下的血小板活化，通过表面CD62P水平(A)的MFI和表面CD62P阳性血小板百分比(B)进行测量。(C)代表性ROTEM曲线，由鞣花酸引发凝血(n=3)。红色阴影区域是全血(WB)和未添加额外输血包(TP)的稀释WB(DWB)之间的区域。(D至G)量化ROTEM凝块形成时间(s)和最大凝块硬度(mm)，用于通过内源途径(C和D)用鞣花酸激活或通过外源途径用凝血活酶激活的凝血(E和F)。虚线代表WB(深红色)和DWB(浅灰色)的硬度。图片来源：《科学进展》(2023)。DOI：10.1126/sciadv.adi0508

功能化脂质纳米颗粒在实验室中的作用

为了研究可电离脂质和辅助脂质的组合如何具有协同效应，以增强蛋白质表达，同时最大限度地减少血小板活化，研究小组研究了两种FDA批准的可电离脂质。除了脂质成分外，mRNA元件在促进外源蛋白质的有效合成方面发挥着重要作用。含有具有磷酸胆碱头部的辅助脂质以及具有分支或不饱和尾部基团的脂质的脂质纳米颗粒最适合血小板转染并驱动更高的表达水平。

在这项工作中测试的RNA修饰中，Leung及其同事指出未修饰的尿苷或假尿苷可促进更高水平的荧光表达。然后，他们观察荧光的表达是否取决于血小板活化程度或递送的RNA量，他们使用相关矩阵分析对此进行了研究。

虽然荧光表达与表面血小板水平或mRNA摄取没有很强的相关性，但他们注意到递送的RNA量与血小板活化之间存在轻微的正相关性。由于NanoLuc表达与表面血小板水平或mRNA摄取没有很强的相关性，因此研究小组测试了在mRNA脂质纳米颗粒转染前后使用激动剂激活血小板来影响其表达的可能性。

血小板治疗模拟稀释性凝血病

在mRNA-脂质纳米颗粒处理之前，用二磷酸腺苷(例如交联胶原相关肽或凝血酶)刺激的血小板的荧光表达显着减少。当梁和团队用激动剂刺激血小板两个多小时时，它们的转录组和蛋白质组发生了实质性的重排。结果表明，外源mRNA的翻译不需要血小板活化。

当研究小组用mRNA脂质纳米颗粒处理血小板时，它们在体外保持了止血功能，并且对其物理和化学环境表现出高度敏感性。研究小组研究了mRNA-脂质纳米粒子转染后血小板是否仍能被激活，并测量了它们的激活状态和对生理激动剂的反应。

研究小组使用旋转血栓弹力测定模型和离体模型测试全血中的血小板活性，测试了转染血小板保留其对凝块硬度和形成速率做出贡献的潜力的能力。研究人员使用稀释的全血和输血包中制备的血小板来模拟稀释性凝血病。

当他们将输血包与稀释的全血结合起来模拟患者发生的疾病时，他们注意到脂质纳米颗粒在体外不会影响血小板凝血病。此外，研究小组还探索了用NanoLuc表达的mRNA脂质纳米颗粒转染的血小板的表达情况，在输注到凝血病啮齿动物体内后，血小板循环并定位到伤口部位。

外表

通过这种方式，JerryLeung及其同事通过使用本来可以执行此任务的天然活性血小板，将分子和细胞疗法靶向输送到感兴趣的脉管系统部位。该团队开发了血小板优化的脂质纳米粒子和mRNA，以成功表达蛋白质，同时在感兴趣的脉管系统部位呈现血小板循环功能和局部积累。

使用血小板优化的mRNA-脂质纳米颗粒可以实现核酸的递送和外源翻译，以拓宽和改造血小板以用于各种临床应用。这种用mRNA-脂质纳米颗粒设计的供体血小板可以治疗急性出血性疾病，在肿瘤学方面具有更广泛的应用。这些输注了优化的mRNA-脂质纳米颗粒的血小板具有功能性可输注，并且可以在脉管系统部位积聚，以进行有效的血小板治疗，从而调节血液疾病。

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