STAMPScreen基因筛查的综合管道

基因工程领域已经积累了一个巨大的工具箱：大量在线数据集、基因编辑工具以及快速且廉价的基因组测序。哈佛大学维斯生物工程研究所、哈佛医学院(HMS)和麻省理工学院媒体实验室的科学家和工程师团队表示，这个谜题中缺失的部分是一个清晰的路线图，可以帮助研究人员找出哪些基因需要被修复。目标、使用哪些工具以及如何解释其结果。

为此，该团队创建了一个用于进行基因筛选研究的综合管道，涵盖从识别感兴趣的目标基因到快速有效地克隆和筛选它们的过程的每一步。

该协议称为基于测序的目标确定和模块化扰动筛选(STAMPScreen)，发表在CellReportsMethods论文“哺乳动物遗传筛选的集成管道”中，相关的开源算法可在GitHub上获取。

“STAMPScreen是一个简化的工作流程，使研究人员可以轻松识别感兴趣的基因并进行基因筛选，而无需猜测使用哪种工具或进行哪些实验来获得他们想要的结果，”作者PranamChatterjee博士说，麻省理工学院媒体实验室前研究生，现任HMS和Wyss研究所的CarlosM.Varsavsky研究员。“它与许多现有的数据库和系统完全兼容，我们希望许多科学家能够利用STAMPScreen来节省时间并提高结果的质量。”

该论文的共同第一作者ChristianKramme博士坐在Wyss研究所的工作台上。【哈佛大学维斯研究所】

Chatterjee和GeorgeChurch博士实验室的博士生、Wyss核心教员兼HMS遗传学教授ChristianKramme的研究通过以下方式探索了生物学不同方面(生育力、衰老和免疫力)的遗传基础：结合数字方法和基因工程的优势。

但两者都遇到了限制。这些算法可以指示基因的表达模式何时发生变化，但无法深入了解该变化的原因。当他们想要测试活细胞中的候选基因列表时，并不清楚他们应该进行什么类型的实验。许多可用于将基因插入细胞并进行筛选的工具昂贵、耗时且不灵活。

“我们认为必须有一种更好的方法来进行此类研究，当我们找不到方法时，我们接受了自己创建它的挑战，”克拉姆说。

Kramme和他的同事概述了建立一个全面运作的端到端基因筛查平台所需的条件。

首先，他们开发了独特的计算算法，可以使用细胞分化的转录组数据并识别关键转录因子。第一种算法对与其他基因高度相关且其活性与大的细胞水平变化相关的基因给予高分。第二种算法生成网络来表示细胞类型分化过程中基因表达的动态变化，然后应用中心性度量(例如Google的PageRank算法)来对该过程的关键调节因素进行排名。

一旦确定了目标基因，STAMPScreen方案就会破坏细胞中的这些基因。研究小组系统地评估了多种基因扰动工具，包括人类诱导多能干细胞(hiPSC)中的互补DNA(cDNA)和几个版本的CRISPR。

然后，他们创建了一种新工具，允许在同一细胞内使用CRISPR和cDNA，以释放两种方法之间的协同作用。例如，CRISPR可用于关闭基因所有亚型的表达，而cDNA可用于依次单独表达每个亚型，从而允许进行更细致的遗传研究并大大减少脱靶基因的背景表达。

然后可以使用该团队名为MegaGate的专利克隆方法将候选转录因子克隆到带条形码的PiggyBac载体中。MegaGate采用大范围核酸酶实现高效克隆，克隆成功率为99.8%，并且可以轻松为载体添加条形码。

“MegaGate不仅解决了我们在旧克隆方法中不断遇到的许多问题，而且还与许多现有的基因库(例如TFome和hORFeome)兼容。您基本上可以从货架上取下Gateway和大范围核酸酶，将它们与基因库和条形码目标载体库放在一起，两小时后您就可以获得感兴趣的条形码基因。我们已经用它克隆了近1,500个基因，而且还没有失败过，”怀斯研究所和HMS的研究生AlexandruPlesa说。

Chatterjee的Twitterfeed解释说，最后，条形码载体可以在iPSC中以不同的拷贝数进行组合筛选，并且可以通过基于条形码的测序以批量和单细胞分辨率读出所得转录组。

该团队预计STAMPScreen可用于多种研究，包括通路和基因调控网络研究、分化因子筛选、药物和复杂通路表征以及突变建模。STAMPScreen也是模块化的，允许科学家将其不同部分集成到他们自己的工作流程中。

“公开的基因数据集中蕴藏着大量信息，”丘奇说，“但只有使用正确的工具和方法来分析这些信息，我们才能理解这些信息。STAMPScreen将帮助研究人员更快地找到灵感，并加快基因工程创新的步伐。”

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